La garrapata del ganado es controlada por pesticidas, que invariablemente conduce a la selección de cepas resistentes. En Brasil, este parásito es actualmente resistente en mayor o menor medida a todos los pesticidas comerciales utilizados por los ganaderos. 

El fármaco antiparasitario más utilizado para controlar las poblaciones de garrapatas del ganado (así como los parásitos humanos) es la ivermectina, un antihelmíntico de amplio espectro, acaricida e insecticida.

El rebaño de ganado comercial de Brasil totalizó 217.7 millones de animales en 2017, según el Ministerio de Agricultura del país. En el mismo año, Brasil fue el principal exportador mundial de carne vacuna, con un total de US $ 6.280 millones.

Las cifras podrían ser aún mayores si no fuera por la enorme pérdida económica anual causada por los parásitos. Se estima que esta pérdida alcanzó al menos US $ 13.9 mil millones en 2014. En otras palabras, el daño causado por los parásitos en términos de mortalidad , pérdida de peso, pérdida de fertilidad y rendimiento reducido es más del doble del valor de las exportaciones anuales.

El peor daño es causado por parásitos internos, como los gusanos gastrointestinales, que causan pérdidas que ascienden a US $ 7,1 mil millones (51 por ciento del total). Luego vienen los parásitos externos, que viven en la piel del ganado o los visitan para alimentarse. Ninguno hace más daño que la garrapata del ganado del sur (Rhipicephalus (Boophilus) microplus), que representa pérdidas anuales que ascienden a US $ 3,2 mil millones (23.2 por ciento). La mosca del cuerno (Haematobia irritans) causa pérdidas de US $ 2.5 mil millones (18.3 por ciento), mientras que el daño causado por la mosca botánica (Dermatobia hominis), la mosca helicoidal (Cochliomyia hominivorax) y la mosca estable (Stomoxys calcitrans) ascienden a US $ 1 billón (7.5 por ciento).

Un artículo publicado recientemente en Scientific Reports describe un estudio en el que investigadores brasileños se afiliaron al Departamento de Genética y Biología Evolutiva del Instituto de Biociencias de la Universidad de São Paulo (IB-USP) y el Instituto de Investigación Veterinaria Desidério Finamor (IPVDF) en Eldorado do. Sul (estado de Rio Grande do Sul) identificó mecanismos de resistencia de la garrapata del ganado a la ivermectina , uno de los medicamentos más utilizados para combatir R. microplus.

La investigación fue apoyada por la Fundación de Investigación de São Paulo, FAPESP y el Consejo Nacional para el Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq).

“La infestación ocurre cuando la garrapata se alimenta de la sangre del animal, ya que al hacerlo, inocula al animal con sustancias antihemostáticas, antiinflamatorias e inmunomoduladoras contenidas en su saliva”, dijo Tatiana Teixeira Torres, quien realizó el estudio con la genetista Valéria Lis Le Gall y Guilherme Marcondes Klafke.

Según Torres, estas sustancias modifican la fisiología del huésped alrededor de la picadura, causando pérdida de sangre y una reducción de la inmunidad y la irritación. “El estrés que experimenta el animal debido a la infestación hace que deje de alimentarse, pierda peso y sea menos fértil”, dijo.

“La ivermectina actúa como un análogo de un neurotransmisor llamado GABA, que se encuentra en los vertebrados e invertebrados”, dijo Torres. “En el caso de la garrapata del ganado, este neurotransmisor funciona uniéndose y activando los receptores de los canales de cloruro regulados por glutamato, que son neurorreceptores exclusivos de los invertebrados. El medicamento actúa a nivel molecular y se une a los canales de cloruro neuronal en la unión neuromuscular y Bloqueando la neurotransmisión, que paraliza los músculos del insecto y causa la muerte “.

La ivermectina fue descubierta en 1975 y ha estado en uso comercial desde 1981. En el caso de la garrapata del ganado, esto significa que innumerables generaciones de R. microplus han estado expuestas al medicamento durante más de tres décadas, el tiempo suficiente para que el insecto desarrolle resistencia al virus. eso.

Según Torres, varios mecanismos en R. microplus pueden estar involucrados en su resistencia a la ivermectina, incluida la capacidad fisiológica para desintoxicar o tolerar sustancias tóxicas. “Los mecanismos metabólicos de la desintoxicación están mediados por familias de enzimas y por proteínas específicas, que han asumido este papel a través del mecanismo de la selección natural”, dijo.

Las garrapatas que carecen de estas enzimas y proteínas murieron en presencia de ivermectina, mientras que las garrapatas que produjeron las sustancias en cuestión sobrevivieron y produjeron más descendientes, que formaron las cepas resistentes a la ivermectina .

Las familias de enzimas que median la desintoxicación en la especie, explicó Torres, incluyen el citocromo P450, las esterasas y las glutatión-S-transferasas (GST).

“Otras proteínas, como los transportadores ABC, también contribuyen al proceso de desintoxicación al transportar sustancias tóxicas al exterior de las células a través del consumo de ATP”, dijo Torres, quien realizó el estudio financiado por la FAPESP.

Bioensayos letales

La desintoxicación de pesticidas mediante un aumento en la actividad del citocromo P450, esterasas, GST y transportadores ABC es bien conocida en varios grupos de artrópodos, incluida la garrapata del ganado R. microplus.

“En nuestro estudio, investigamos los mecanismos de desintoxicación en el trabajo en una cepa de R. microplus resistente a la ivermectina en comparación con una cepa que es susceptible al pesticida”, dijo Torres.

“Analizamos la desintoxicación de ivermectina en ambas cepas utilizando bioensayos de tiempo letal en presencia de inhibidores que bloquean la actividad enzimática o transportadora de las proteínas estudiadas, permitiendo que prevalezcan los efectos tóxicos de la ivermectina y, por lo tanto, aumente la tasa de mortalidad”.

El objetivo del estudio fue identificar las proteínas que desempeñan un papel clave en la desintoxicación de ivermectina en una cepa de garrapatas de ganado multirresistente. Para probar la influencia de estas proteínas en la resistencia a los medicamentos, los investigadores utilizaron inhibidores específicos de cada familia de proteínas y compararon las tasas de mortalidad resultantes del tratamiento con ivermectina con o sin los inhibidores.

Los inhibidores fueron sustancias capaces de inducir alteraciones que impiden la actividad de desintoxicación: butóxido de piperonilo (PBO) para el citocromo P450, S, S, S-S-tributil fosforotritioato (DEF) para las esterasas, maleato de dietilo (DEM) para GST, y ciclosporina A (CsA) Para los transportistas ABC.

Se usaron dos cepas de R. microplus en los bioensayos. La cepa susceptible fue Mozo, originaria de Uruguay y utilizada en pruebas de diagnóstico de resistencia en América Latina. Se mantuvo en IPVDF sin ningún contacto con acaricidas.

Según Torres, la cepa resistente a la ivermectina era Juárez, aislada en 2010 en el municipio de Jacareí, estado de São Paulo. Originalmente se recolectó a partir de garrapatas hembras engordadas en una granja de ganado donde se había informado que no se controlaban las poblaciones de garrapatas con ivermectina. Juárez es una cepa resistente a múltiples fármacos con baja mortalidad por otros pesticidas, además de la ivermectina, como la cipermetrina, amitraz, clorpirifos y fipronilo. El estudio realizado en IB-USP se limitó a la ivermectina.

Se realizaron dos baterías separadas de bioensayos letales. El primero fue diseñado para medir la acción letal de la ivermectina sola en Mozo, la cepa susceptible, y Juarez, la cepa resistente. Se colocaron aproximadamente 100-150 larvas de garrapatas en un paquete de papel, que se incubó durante diez minutos en una solución que contenía ivermectina.

Según Torres, cuando se eliminó el paquete de la solución, se midió la mortalidad contando el porcentaje de larvas en cada muestra que murió después de una exposición dada a la ivermectina. Esta medición se realizó a los 10 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas y 24 horas.

“Los resultados de la primera batería de bioensayos de tiempo letal mostraron una clara diferencia en la respuesta con el tiempo al tratamiento de las larvas con ivermectina sola”, aseguró Torres.

“Después de cuatro horas de exposición, todas las larvas de la cepa susceptible [Mozo] habían muerto, mientras que la tasa de mortalidad entre las larvas de la cepa resistente [Juárez] había alcanzado solo el 40 por ciento. Esta proporción se mantuvo constante 24 horas después de la exposición. La dosis que mató a la cepa susceptible no mató a la cepa resistente “.

La segunda batería de bioensayos nuevamente utilizó las cepas susceptibles y resistentes, pero en este caso, la solución letal no solo contenía ivermectina sino también uno de los cuatro inhibidores que bloquean la acción de las enzimas y transportadores desintoxicantes.

Los cuatro inhibidores se probaron individualmente en cinco concentraciones diferentes que oscilaron entre 1.88 y 30 micromolar (μM) con el objetivo de determinar los niveles ideales (no tóxicos) de los inhibidores en ausencia de ivermectina. Una vez que se encontró la dosis no letal más alta de cada inhibidor, se utilizaron por separado en combinación con ivermectina para explorar el papel de las proteínas en la resistencia a los medicamentos mediante su inhibición.

Por ejemplo, si una enzima es responsable de la desintoxicación de ivermectina y reduce la mortalidad en la cepa resistente a la garrapata, su inhibición aumentará la mortalidad, lo que puede alcanzar un nivel similar a la tasa de mortalidad de la cepa susceptible.

Los investigadores encontraron que la inhibición de las cuatro familias de proteínas elevaba la mortalidad a diferentes grados. “Nuestros resultados mostraron que los transportadores ABC desempeñaron el papel más importante en la resistencia mostrada por la cepa Juárez”, dijo Torres. “Cuando se inhibieron con la ciclosporina A, las tasas de mortalidad fueron muy similares a las observadas en la cepa susceptible. El uso de otros inhibidores [PBO, DEF y DEM] también condujo a una mayor mortalidad en la cepa resistente, pero las enzimas inhibidas jugaron Un papel menos importante en la desintoxicación “.

Durante los bioensayos letales con la cepa resistente (Juarez), los mejores resultados se obtuvieron cuando las larvas se colocaron en una solución que contenía ivermectina y ciclosporina A (CsA) a 12 μM.

Después de que las larvas resistentes fueron expuestas a la ivermectina sola, el 40 por ciento murió en cuatro horas y la misma proporción en 24 horas, mientras que la exposición al pesticida más CsA causó la muerte del 50 por ciento en 3 horas y 20 minutos y aproximadamente el 100 por ciento en 24 horas. .

“Curiosamente, el tiempo letal para una mortalidad del 50 por ciento en la cepa resistente cuando se expuso a la ivermectina combinada con CsA se parecía mucho al tiempo letal para la mortalidad del 50 por ciento en Mozo, la cepa susceptible, cuando se expone a la ivermectina sola, evidenciando una reversión casi completa de la Fenotipo resistente de la cepa de Juárez “, dijo Torres.

“El efecto sinérgico de CsA se demostró mediante un aumento del 60 por ciento en la mortalidad en la cepa expuesta a la combinación de ivermectina y CsA en comparación con la de la misma cepa expuesta solo a la ivermectina después de 24 horas”.

Los resultados proporcionan evidencia de la acción de los mecanismos de desintoxicación en R. microplus resistente a la ivermectina, lo que contribuye al conocimiento de las bases moleculares subyacentes al fenotipo resistente a la ivermectina.

“Este conocimiento puede ayudarnos a encontrar nuevas estrategias para lidiar con la resistencia a la ivermectina en el campo”, dijo Torres. “Por ejemplo, los inhibidores que probamos u otras moléculas con efectos similares podrían incluirse en formulaciones comerciales de ivermectina”.

Las diferencias en las actividades de las proteínas estudiadas podrían deberse a diferencias entre las cepas susceptibles y resistentes en la estructura, secuencia o expresión de los genes que codifican estas proteínas. Como parte del mismo proyecto más amplio, los investigadores ahora están investigando las sustituciones en las secuencias de codificación de los genes que pertenecen a estas cuatro familias, así como las alteraciones en el nivel de su expresión.

“Este análisis nos ayudará a establecer las relaciones causales entre la función del gen y la resistencia metabólica a la ivermectina”, dijo Torres.